多孔膜集成芯片技术在血脑屏障（BBB）模型构建与药物通透性研究中的应用

多孔膜集成芯片结合高精度注射泵（模拟血流剪切力），构建三细胞（内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞）共培养的血脑屏障（BBB）体外模型。通过动态流体控制促进屏障成熟，并检测药物通透性（HPLC/荧光分析），并检测透过BBB后的药物浓度，实现高仿生药物筛选及病理机制研究。

一、实验设计核心思路

1. 构建三细胞共培养的BBB模型：
   在微流控芯片中模拟血管腔（内皮细胞层）和脑组织腔（星形胶质细胞+周细胞），通过动态流体模拟血流剪切力，形成功能性屏障。

2. 药物跨BBB渗透实验：
   在血管腔侧施加药物，通过芯片设计使药物穿透BBB后进入脑组织腔，收集脑腔侧液体检测药物浓度。

3. 定量检测方法：
   根据药物性质（分子量、荧光特性、化学稳定性等）选择高灵敏度检测手段（如HPLC、LC-MS、荧光分析）。

二、具体实验步骤

1. 微流控芯片设计与制备

• 芯片结构：

• 双通道设计(多孔膜集成芯片)：

• 血管腔（上层）：铺内皮细胞，模拟血液侧。

• 脑组织腔（下层）：铺星形胶质细胞和周细胞，模拟脑组织侧。

• 分隔膜：中间使用多孔膜（孔径0.4~3 μm，如聚碳酸酯膜，光刻阵列膜）分隔两腔，允许物质交换但阻止细胞迁移。

• 3D支持（可选）：在脑腔侧填充水凝胶（如胶原蛋白/Matrigel），模拟细胞外基质。

图1：滤膜集成芯片

2. 推荐孔径范围与替代方案

1. 常规BBB模型的孔径选择

• 建议孔径：0.4~3 μm（常用聚碳酸酯或聚酯膜），具体选择依据：

• 0.4 μm：严格限制细胞迁移，适合高屏障完整性模型（如药物筛选）。

• 1~3 μm：允许少量细胞旁路渗透（模拟病理渗漏），同时维持内皮单层。

• 示例：

• Transwell体系常用3 μm孔径膜，但微流控芯片因动态剪切力需更小孔径（通常1 μm以下）。

2. 光刻多孔阵列膜（可定制孔径5um以上）的应用场景

• 适用场景：研究细胞迁移（如肿瘤转移或炎症浸润）而非标准BBB屏障功能。

• 改进措施：

1. 膜表面修饰：

• 涂覆细胞外基质（如胶原、纤连蛋白）以促进内皮细胞粘附和单层形成。

2. 细胞接种优化：

• 提高内皮细胞密度（如2×10⁵ cells/cm²），加速单层闭合。

• 在周细胞和星形胶质细胞接种前，确保内皮层已完全覆盖膜孔。

3. 功能验证强化：

• 频繁监测TEER值，屏障成熟后尽快开展实验（避免长期培养导致细胞迁移）。

• 通过免疫荧光确认紧密连接蛋白（ZO-1）的连续性。

  

                图2. 光刻多孔阵列膜电镜图
  

孔径与细胞行为的对应关系

总结与建议

• 常规BBB模型：优先选择0.4~3 μm孔径膜，确保内皮单层稳定性和屏障功能。

• 特殊需求（如8 μm膜）：需明确实验目标（如细胞迁移研究），并通过膜修饰、细胞接种优化和严格功能验证弥补孔径缺陷。

• 验证实验：无论孔径如何，必须通过TEER、荧光标记物渗透性（如FITC-dextran）和免疫荧光确认模型有效性。

• 动态流体系统：

• 连接高精度注射泵（mifluidic，JSP-02-1A），在血管腔侧施加剪切力（流速：0.1~10 μL/min，模拟生理血流）。

• 脑腔侧可保持静态或低流速，模拟脑组织间液环境。

3. 三细胞共培养与BBB模型建立

• 细胞接种顺序：

1. 周细胞：先接种在脑腔侧的多孔膜下表面（或水凝胶中）。

2. 星形胶质细胞：接种在周细胞周围或水凝胶中，形成支持网络。

3. 内皮细胞：最后接种在血管腔侧的多孔膜上表面，形成单层屏障。

• 培养条件：

• 内皮细胞培养基（如EGM-2）+ 周细胞/星形胶质细胞共培养基（如DMEM/F12 + 生长因子）。

• 动态培养：血管腔侧持续灌注培养基（剪切力约4 dyn/cm²），共培养5~7天形成成熟屏障。

4. 模型验证（关键！）

• 屏障完整性检测：

• 跨内皮电阻（TEER）：使用电极测量TEER值（成熟BBB模型通常>200 Ω·cm²）。

• 荧光标记物通透性：

• 血管腔侧加入FITC-dextran（70 kDa，不可透过完整BBB），检测脑腔侧荧光强度随时间变化。

• 合格标准：渗透系数（Papp）< 1×10⁻⁶ cm/s。

• 免疫荧光验证：

• 检测内皮细胞紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-5）的表达及分布。

5. 药物通透性测试

• 药物施加：

• 在血管腔侧灌注含药物的培养基（浓度根据实验需求设定）。

• 控制流速模拟生理剪切力（通常0.5~5 μL/min）。

• 样本收集：

• 时间点：根据药物性质选择（如0.5 h、1 h、2 h、4 h、24 h）。

• 脑腔侧取样：从脑腔出口收集液体，避免污染（可使用微量注射器或自动分液系统）。

• 对照组设置：

• 空白对照：无细胞的芯片，检测药物非特异性渗透。

• 阳性对照：使用已知高通透性药物（如丙戊酸钠）和低通透性药物（如甘露醇）。

6. 药物浓度检测方法

三、关键注意事项

1. 避免药物吸附：

• PDMS材质易吸附疏水性药物，可改用聚碳酸酯（PC）或环烯烃共聚物（COC）芯片，或在PDMS表面涂覆Pluronic F-127减少吸附。

2. 细胞活性维持：

• 长时间实验需实时监测细胞活性（如Calcein-AM/PI双染色），避免剪切力损伤。

3. 数据标准化：

• 根据芯片体积和流速计算药物渗透率（如单位时间单位面积的渗透量）。

• 公式示例：渗透率 Papp = (ΔQ)/(A×C₀×Δt)，其中ΔQ为脑腔侧药物量，A为膜面积，C₀为初始药物浓度。

四、替代方案与扩展

• 简化模型：若时间受限，可先使用内皮细胞单层（不含周细胞/星形胶质细胞）进行初筛，但需注意屏障功能可能较弱。

• 高通量版本：采用多通道芯片并行测试多个药物，结合自动化液体处理系统。

• 病理模型：在芯片中模拟炎症（如添加TNF-α）或肿瘤微环境，研究病理状态下药物通透性变化。

五、常见问题与解决方案

以上方案仅供参考。