如何利用高精度注射泵生成BHM水凝胶微球合成方案

本实验参考方案基于微流控芯片技术，通过使用武汉简米智控的高精度注射泵（JSP-02-1A）达到精确控制水相（含丙烯酰胺/DNA引物）和油相（HFE-7500/表面活性剂）流速（400/900 μL/h），生成63 μm单分散液滴。经阶梯升温（37℃→65℃）聚合12小时，获得多孔水凝胶微球。通过氟化溶剂清洗和Span 80/己烷纯化，最终得到弹性模量~1 kPa、含100 nm孔隙的DNA功能化BHM，适用于生物检测和分子诊断，储存于TEBST缓冲液（4℃）。

一、材料准备

1. 芯片系统：

• 微流控芯片：推荐采用玻璃毛细管流动聚焦芯片或商业化PDMS芯片

• 注射泵：双通道精密注射泵（mifluidic,JSP-02-1A）

2. 试剂：

• 分散相：丙烯酰胺溶液（配方见附录）

• 连续相：HFE-7500油相（含1.8% EA-surfactant，需预平衡至25℃）

• 清洗试剂：全氟辛醇/HFE-7500（20% v/v）、Span 80/己烷（1% v/v）

• 聚合终止液：0.1 M硫代硫酸钠（紧急终止聚合用）

二、实验流程

Step 1 微流控液滴生成

1. 芯片预处理：

• 用1% Pluronic F127水溶液冲洗油相通道30 min，降低非特异性吸附

• 两相预平衡至25℃（温度波动<0.5℃）

2. 液滴参数：

• 水相流速：400 μL/h（建议使用Hamilton 100 μL玻璃注射器）

• 油相流速：900 μL/h

• 监测液滴直径：实时显微成像（目标63±3 μm，CV<5%）

Step 2 原位聚合

1. 聚合条件优化：

• 收集管预装200 μL矿物油（含0.02% EA-surfactant）

• 阶梯式升温程序：37℃ 1h → 45℃ 2h → 65℃ 9h（减少热应力）

2. 聚合终止：

• 加入50 μL硫代硫酸钠终止反应（可选）

Step 3 后处理纯化

1. 破乳清洗：

• 采用密度梯度分离：依次加入20%全氟辛醇/HFE-7500 → 50% HFE-7500/FC-40      → 纯FC-40

• 离心参数：3000 rcf ×5 min（Beckman Coulter      Allegra X-15R）

2. 表面修饰：

• Span 80/己烷清洗时加入0.01% TWEEN20提高分散性

• 离心后立即用N2吹扫去除残留溶剂

Step 4 储存与质检

1. 储存条件：

• 重悬于含0.02% NaN3的TEBST缓冲液（4℃避光保存）

2. 质量控制：

• 粒径检测：Malvern Mastersizer 3000

• 机械性能：原子力显微镜（AFM）测定弹性模量

• 孔径分析：荧光标记葡聚糖排阻实验

三、关键参考文献

1. 微流控设计：

• Zhu & Wang (2017) Lab Chip 17(13):      2155-2163（芯片表面处理）

• Utada et al. (2005) Science 308(5721):      537-541（流动聚焦理论）

2. 水凝胶合成：

• Bong et al. (2010) Angew. Chem. 49(1): 87-90（丙烯酰胺低温聚合）

• Kim et al. (2013) Adv. Mater. 25(12):      1682-1686（梯度升温法）

3. 表面活性剂：

• Abate et al. (2009) Lab Chip 9(18): 2628-2631（氟化表面活性剂筛选）

四、实验注意事项

1. 安全操作：

• 丙烯酰胺需在通风橱配制，聚合前溶液需避光冷藏

• 氟化液体操作需佩戴全氟橡胶手套（如Chemrest® HF）

2. 关键控制点：

• 引发剂顺序：先加APS再加TEMED（间隔>30秒）

• DNA引物建议在聚合后通过迈克尔加成接枝（避免高温损伤）

3. 故障排除：

• 液滴融合：检查EA-surfactant批间差异（建议用Ran Biotech      008-FluoroSurf）

• 聚合不完全：预脱气处理（真空度<10 mbar ×30 min）

4. 新手建议：

• 首次实验建议用荧光素钠（1 mM）示踪水相

• 备选方案：可采用微孔板法（20-100 μm）替代微流控

附录：关键溶液配方

分散相（现用现配）：

TEBST缓冲液（灭菌过滤）：

• 10 mM Tris-HCl (pH8.0)

• 137 mM NaCl

• 2.7 mM KCl

• 10 mM EDTA

• 0.1% Triton X-100

• 0.02% NaN3（防腐剂）

本方案通过梯度升温降低内应力、优化表面活性剂配比提高单分散性，并增加质检环节确保结果可靠性。建议新手先在PDMS芯片上进行亚甲蓝染色预实验，待液滴生成稳定后再开展正式实验。以上实验方案仅供参考。