多孔膜集成微流控双层芯片的细胞培养简介

使用微流控双层集成芯片（中间含多孔膜）进行细胞培养的流程可分为芯片设计、细胞接种、动态培养和检测分析四个阶段。以下是详细步骤和注意事项：

一、芯片设计与制备

1. 芯片结构设计

• 双层结构：上层为细胞培养腔（模拟组织或血管腔），下层为灌注腔（培养基流动），中间通过多孔膜（孔径0.4-8μm）分隔。

• 多孔膜材料：聚碳酸酯（PC）、聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）或PDMS膜，需根据细胞类型选择孔径（例如：内皮细胞常用1-3μm）。

• 微流道尺寸：通道宽度100-500μm，高度50-200μm，需匹配细胞尺寸和流体剪切力需求。

2. 芯片加工

• 材料选择：

• PDMS（聚二甲基硅氧烷）：常用材料，生物相容性好，可通过软光刻法加工。

• 玻璃或PMMA（有机玻璃）：用于芯片基底或盖片，提高稳定性。

• 制备步骤：

1.      使用光刻技术在硅片上制作SU-8模板。

2.      将PDMS预聚体与固化剂（比例10:1）混合，浇注到模板上，抽真空除气泡。

3.      80℃固化1小时，剥离PDMS层，打孔形成进样口和出样口。

4.      多孔膜整合：

• 方法1：将预制的多孔膜（如Transwell膜）夹在上下层PDMS之间，用氧等离子体处理（30W，30秒）键合。

• 方法2：直接通过微加工（如激光打孔或刻蚀）在PDMS层中间形成多孔结构。

5.      键合芯片：将上下层PDMS与多孔膜对齐，加压加热（70℃, 30分钟）或使用生物相容性胶水（如Norland OpticalAdhesive）密封。

二、芯片灭菌与预处理

1. 灭菌处理

• 高压蒸汽灭菌：121℃、15分钟（适用于耐高温材料如玻璃、PET膜）。

• 紫外照射：将芯片暴露于紫外线下30分钟（PDMS芯片需避免长时间紫外老化）。

• 乙醇浸泡：75%乙醇浸泡2小时，PBS冲洗3次去除残留。

2. 表面修饰（可选）

• 细胞黏附增强：

• 用0.1mg/ml多聚赖氨酸（PLL）或纤连蛋白（Fibronectin）溶液灌注芯片，37℃孵育1小时。

• 胶原蛋白涂层：注入1mg/ml胶原蛋白（Col-I），4℃过夜。

三、细胞接种与静态培养

1. 细胞悬液准备

• 消化细胞至单细胞悬液，密度调整至1×10⁶ cells/ml（高密度适用于贴壁困难细胞）。

• 加入含5% FBS的培养基减少剪切力损伤。

2. 细胞加载

• 上层接种：

1. 从上层进样口注入50-100μl细胞悬液，静置10分钟使细胞沉降到多孔膜表面。

2. 翻转芯片，使细胞贴附于膜上表面（模拟基底侧）。

• 下层接种：若需共培养（如内皮细胞+上皮细胞），反向注入另一细胞类型至下层腔室。

3. 静态培养

• 将芯片放入培养箱（37℃, 5% CO₂），静置4-6小时使细胞贴附。

• 补充培养基至完全覆盖细胞层，避免干燥。

四、动态灌注培养

1. 连接流体控制系统

• 使用注射泵或气压泵以低流速（0.1-10μl/min）灌注培养基。

• 剪切力控制：根据细胞类型调节流速（例如：内皮细胞通常耐受1-10 dyn/cm²）。

2. 培养基循环

• 采用连续灌注或间歇换液模式（如每24小时更换50%培养基）。

• 共培养系统：上下层可分别灌注不同培养基（如上层为组织特异性培养基，下层为血管灌注液）。

五、实时监测与终点分析

1. 在线监测

• 显微镜观察：通过芯片透明窗口使用倒置显微镜或共聚焦显微镜观察细胞形态。

• 传感器集成（可选）：pH、氧分压或葡萄糖传感器实时监测微环境。

2. 终点检测

• 跨膜电阻（TEER）：通过电极测量多孔膜两侧电阻值评估细胞屏障完整性。

• 荧光染色：

1. 注入Calcein-AM（活细胞）/PI（死细胞）染色，共聚焦显微镜成像。

2. 免疫荧光：固定细胞后标记ZO-1（紧密连接）或F-actin（细胞骨架）。

• 跨膜迁移实验：在下层腔室加入趋化因子（如SDF-1），分析细胞透过多孔膜的数量。

六、关键注意事项

1. 防泄漏设计：键合前确保多孔膜与PDMS接触面平整，可通过等离子体处理提高粘附性。

2. 气泡控制：灌注前用脱气培养基预润湿通道，避免气泡阻塞微流道。

3. 剪切力优化：通过计算流体力学（CFD）模拟确定最佳流速，避免细胞脱落。

4. 无菌操作：在超净台内完成细胞加载步骤，使用0.22μm滤器过滤灌注液体。

示例应用：血脑屏障模型构建

1. 上层接种人脑微血管内皮细胞（HBMEC），下层为星形胶质细胞。

2. 灌注5% CO₂平衡的ECM培养基，流速2μl/min模拟生理血流。

3. 通过TEER值>200 Ω·cm²确认屏障形成后，进行药物渗透性测试。

通过以上流程，可建立高度仿生的体外细胞培养模型，适用于药物筛选、病理机制研究和组织工程等领域。